Cuantificación del porcentaje de leche de distintas especies animales en quesos mezcla

Los quesos de mezcla de leche de diferentes especies se producen principalmente en países mediterráneos como España, Francia, Italia o Grecia. Algunos están protegidos por denominaciones de origen o indicaciones geográficas, lo que representa un valor añadido para el consumidor. En España el 40 % del queso que se produce es queso de mezcla, es decir, fabricado con dos o tres especies de leche. La relevante presencia de quesos de oveja y cabra se explica porque España es el primer y segundo productor de leche de oveja y cabra, respectivamente, de Europa.

La elaboración y etiquetado de estos quesos en España está regulada por diversas normativas, algunas de las cuales aplican a quesos de mezcla como el ibérico (Real Decreto 262/2011) en la que se establecen los requisitos de composición en cuanto a leche de vaca, cabra, y oveja. Sin embargo, los Consejos Reguladores de las Denominaciones de Origen Protegidas (D.O.P) y las Indicaciones Geográficas Protegidas (I.G.P) de quesos de mezcla (Flor de Guía, Quesucos de Liébana, Cabrales, Gamoneu, etc.) suelen ser menos específicos en cuanto a la composición por especies.

La industria quesera demandaba desde hace tiempo un método fiable para cuantificar la composición de mezclas de leche en queso. Ello permitiría garantizar la calidad de los quesos, protegiendo al consumidor de posibles fraudes y riesgos para la salud. Los test rápidos realizados diariamente para controlar la calidad de la leche recogida y detectar adulteraciones por mezclas de leche no son útiles para este propósito.

Ante esta carencia, la Organización Interprofesional Láctea (InLac) lanzó una convocatoria pública para desarrollar una técnica de cuantificación de leche de diferentes especies en quesos y que pudiese ser aplicada por los laboratorios de análisis. La propuesta presentada por el laboratorio de proteómica del Centro Nacional de Biotecnología – CSIC, en colaboración con ZEULAB y Laboratorios Arroyo, resultó la ganadora de la convocatoria con una metodología novedosa basada en el uso de espectrometría de masas y proteómica dirigida.

Esta técnica permite detectar, con un alto nivel de sensibilidad y selectividad, fragmentos provenientes de la rotura selectiva de proteínas presentes en la leche y en el queso de diferentes organismos. Algunos de estos fragmentos, llamados péptidos, aunque son muy semejantes en su estructura (secuencia), presentan diferencias características de las especies de interés (vaca, oveja y cabra) y que podemos detectar mediante proteómica dirigida. Los fragmentos o péptidos monitorizados se generan a partir de las muestras de queso mediante un procedimiento llamado digestión enzimática, en el que utilizamos una enzima (proteasa) de alta sensibilidad y especificidad, llamada tripsina.

Los primeros ensayos realizados mostraron que el análisis permitía identificar unos 450-500 fragmentos (péptidos) diferentes, correspondientes a unas 100 proteínas. Un porcentaje mayoritario de los fragmentos es común o idéntico a las especies estudiadas mientras que el minoritario es específico. Los fragmentos o péptidos monitorizados en la versión final del ensayo se seleccionaron a través de un proceso iterativo prueba-error que, partiendo de un número inicial de 61 fragmentos específicos de especie, fue testando su grado de especificidad, estabilidad y reproducibilidad.

Los primeros análisis permitieron obtener una lista reducida formada por solamente 9 péptidos específicos de especie, provenientes de 3 proteínas diferentes, y 3 péptidos comunes a las 3 especies. Una nueva ronda de iteraciones redujo la lista a otra formada por 3 péptidos específicos de especie y un péptido común a las 3 especies, que fueron los que se utilizaron para la optimización de la técnica analítica y su validación. El método final se simplifica como sigue:

1. Extracción de las proteínas del queso, digestión de las mismas y obtención de los péptidos, a los que se añaden una serie de controles internos.
2. Separación y análisis de los péptidos mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas dirigida (LC-MS) en modo dirigido.
3. Aplicación de los algoritmos e interpretación de los resultados

Los resultados demostraron la linealidad del método en un rango entre 0 % a 100 % para las tres especies estudiadas. Se ha determinado un límite de detección inferior al 1 % para cada especie y un límite de cuantificación inferior al 2 %. El estudio ha mostrado valores medios de reproducibilidad del 10 % y del 99,6 % de recuperación (exactitud). Los datos indican que el método es fiable para el propósito para el que ha sido diseñado, es decir, la determinación de la cantidad de proteína de la leche de cada especie (vaca, oveja, cabra) en las muestras de queso.

Como último paso, desde InLac se propuso normalizar el método para así consensuar la metodología con el resto de interlocutores de la cadena del sector lácteo (Administración pública, productores, industria, distribución y entidades colaboradoras), y también facilitar su uso y difusión.

Estos trabajos de normalización se han llevado a cabo en el Subcomité UNE de Leche y productos lácteos (CTN-UNE 34/SC 5) en el que hay representación nacional de la Administración pública, el sector lácteo, el sector de la distribución alimentaria, centros de investigación y laboratorios del ámbito alimentario.

Como resultado de este trabajo, se ha publicado la Especificación UNE 0084:2024 Quesos de mezcla. Cuantificación del porcentaje de proteína de leche de vaca y/u oveja y/o cabra mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas dirigida (LC-MS) en formato PRM (Parallel Reaction Monitoring, proporcionando así al sector una gran herramienta para poner en valor sus buenas prácticas de fabricación y a los consumidores una garantía de calidad y seguridad.

La Organización Interprofesional Láctea (InLac) está muy satisfecha por haber logrado para el sector lácteo el primer método de cuantificación de leches de diferentes especies en quesos mezcla. Queremos agradecer el gran trabajo, esfuerzo y apoyo prestado por UNE en este ámbito, que ha sido esencial e imprescindible para cerrar el ciclo.

El método es revolucionario, puesto que las técnicas disponibles hasta el momento tenían un carácter de detección, permitiendo conocer tan sólo la ausencia o presencia de leche de vaca, oveja o cabra, pero sin llegar a cuantificar con precisión el porcentaje de cada una de ellas.

InLac ha impulsado este innovador proyecto de I+D+i con el apoyo de Zeulab, el Centro Nacional de Biotecnología del CSIC y Laboratorios Arroyo y la participación de  la Federación Nacional de Industrias Lácteas (FeNIL), empresas del sector quesero, el Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, la Dirección General de Consumo, ENAC, la Asociación Española de Distribuidores, Autoservicios y Supermercados (ASEDAS), laboratorios interprofesionales lácteos y UNE. Los quesos de mezcla son elaborados principalmente en países mediterráneos como España y, muchos de ellos, están protegidos por denominaciones de origen o indicaciones geográficas (el 40 % del queso que se produce hoy en día).

La autenticidad de los quesos es de gran importancia para los servicios oficiales de control de calidad alimentaria, protegiendo a los consumidores y a los operadores de toda la cadena láctea. Ahora, gracias al apoyo y a los equipos de UNE, el método podrá ser aplicado para cumplir los ambiciosos objetivos marcados.